人腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒說明書（二） 
上海原鑫生物科技從事科研試劑的優質企業。該文章詳細的介紹了人腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒的樣本收集及儲存、試劑準備、檢測步驟、結果判斷、參數表征和常見問題及解決方法這六個方面。本文僅供于科研研究，不得用于臨床試驗！
一、樣本收集及儲存
1. 細胞培養上清： 將細胞培養基移至無菌離心管，在 4℃條件下1000 ×g 離心10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并 于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。 2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。 3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混 合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。 注意事項：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高 于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。
二、試劑準備
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下復溫。 2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用超純水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。 3. 標準品梯度稀釋：在標準品中加入1ml標準品稀釋液至完全溶解，按照濃度為2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156.25pg/ml、78.13pg/ml、39.06pg/ml進行等比稀釋，具體操作如下圖所示。
三、檢測步驟
1. 按照實驗設計，在標準品與樣本孔中加樣100ul，空白對照不加 2. 25℃避光孵育2h 3. 棄去液體，用洗滌液清洗4次，每次每孔至少加洗滌液300ul，洗完后吸水紙上拍干 4. 加入酶標抗體溶液100ul，空白對照不加，25℃避光孵育1h 5. 同步驟3 6. 每孔加入底物A、B各50ul，25℃避光孵育20min，顯色淺可適當延長孵育時間 7. 加入終止液50ul，10min內在450nm波長處測OD值
四、結果判斷
1. 用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。 2. 計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值 3. 以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中TNFA含量可通過對應OD 值由標準曲線換算出相應的濃度。 若標本 OD 值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數
五、參數表征
1.數據及標準曲線
2. 準確度：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R>0.95 3. 檢測范圍：39.06-2500pg/ml(如超出檢測范圍，需將樣本稀釋后檢測) 4. 靈敏度：≤39.06pg/ml 4 特異性：不與其他可溶性結構類似物交叉反應 5 重復性：變異系數≤15% 6 儲存條件：2-8℃冷藏 7 有效期：6個月
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